乳酸菌细胞吸附霉菌毒素以减除霉菌毒素的毒害作用阅读次数 [5782] 发布时间 :2017-09-20
乳酸菌细胞吸附霉菌毒素以减除毒素的毒害作用
胡文锋，李希，雷柳琳，庞旭，徐健，周舟
（华南农业大学食品学院，广州五山，510642）
摘译、改写自：Amal S. Hathout, Soher E. Aly
Biological detoxification of mycotoxins: a review
Ann Microbiol (2014), 64:905-919.
霉菌产生的霉菌毒素污染了25％人类消费的谷物和粮食，其中，黄曲霉毒素的毒性最大(Wild and Turner, 2002; CAT, 2003) 。黄曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉菌（Aspergillus parasiticus）和红绶曲霉（Aspergillus nomius）污染的玉米、高粱、大米、花生、坚果、无花果、生姜、肉豆蔻和牛奶，可产生对肝脏致癌的黄曲霉毒素(Ellis et al., 1991; FDA, 2012) 。黄曲霉毒素是由一些曲霉属真菌合成的低分子量的次级代谢产物。黄曲霉毒素包括四种类型，分别是黄曲霉毒素B1（最致癌）、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2。它们在兔子体内的最大半致死剂量（LD50）值为0.3mg / kg BW，老鼠为18mg / kg BW(Moss, 1998；IARC, 2002; FDA, 2012)。2012年，黄曲霉毒素被国际癌症研究机构归类为1类致癌物质(i.e., carcinogenic to humans; IARC, 2014) 。
许多国家经常报道食品和饲料中发现了黄曲霉毒素污染。例如，有报告显示，农产品被高水平的黄曲霉毒素B1污染，包括干果、谷物、水果、蔬菜、香草和香料，其最高含量超过了最大允许限度(Chen et al., 2013; Guchi, 2015; Waliyar et al., 2015) 。此外，牛奶和奶制品（包括奶酪，酸奶和奶油）中出现黄曲霉毒素M1的污染，甚至在巴氏杀菌后的牛奶中仍存在(Yitbarek and Tamir, 2013) 。此外，在Greater Addis Ababa奶牛棚里，发现在牛奶和乳牛饲料中有高水平的黄曲霉毒素，污染水平分别为0.028-4.98μg/ L和70-419μg/ L (Gizachew et al., 2016) 。
减少霉菌毒素对人和动物毒素作用的常用方法是利用各种霉菌毒素结合剂或吸附剂来降低其生物利用度，从而减少霉菌毒素的摄取。近年来人们开发了物理、化学和生物的方法去除食品或饲料中的霉菌毒素。本文只介绍乳酸菌的吸附去毒作用及机制。
双歧杆菌属去除霉菌毒素
双歧杆菌是乳酸菌之一，革兰氏阳性，无运动性，经常分支的厌氧细菌属。它们是普遍存在于哺乳动物和其他动物的胃肠道和口腔内共生菌，其中一些双歧杆菌是益生菌。 Peltonen等人（2001）研究了五种双歧杆菌菌株在磷酸盐缓冲液（PBS）中的对黄曲霉毒素B1（AFB1）的结合能力，发现双歧杆菌菌株结合AFB1的18.0-48.7％。Fuchs等（2008）通过双歧杆菌研究了两种丰富的常见的霉菌毒素，赭曲霉毒素A（Ochratoxin A, OTA）和棒曲霉毒素（patulin，PAT）的解毒作用，发现两株长双歧杆菌（LA 02，VM 14）菌株的解毒作用非常高效，OTA降低了约50％；而对于PAT，用动物双歧（VM12）菌株观察到最强的作用（约降低80％）。Hateb等人（2012a）报道，双歧杆菌671在培养24小时后，其最大吸附值达活细胞52.9％，灭活细胞54.1％。
有人研究了两株乳制品源的双歧杆菌在磷酸缓冲液（PBS）和复原乳中去除AFM1的能力，结果表明活细胞（10^8 CFU/ml）和热灭活双歧杆菌对黄曲霉毒素M1去除率分别达到14.04％至28.07％，在PBS和复原乳中分别为12.85％至27.31％（Kabak和Var 2008）。以前的研究还发现，长双歧杆菌和两歧双歧杆菌的AFM1结合能力分别达到26.7％和32.5％（Kabak和Var 2004）。
另外，Lankaputhra和Shah（1998）研究了9株双歧杆菌的活细胞和灭活细胞对八种化学诱变剂和前诱变剂（promutagens）（N-甲基，N'-硝基，N-亚硝基胍，2-硝基呋喃，四氢呋喃，四氢呋喃， ，2-硝基喹啉-N-氧化物; AFB1; 2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并喹啉; 2-氨基-1-甲基-6-苯基 - 咪唑并（4,5-b）吡啶 ，和2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并（3,3-6）吲哚））的抗诱变活性，包括。 作者报道，其中6株双歧杆菌对抑制AFB1毒性其效果不明显。
乳酸菌（乳杆菌）去除霉菌毒素
Aflatoxins 黄曲霉毒素
乳酸菌（LAB）的某些乳制品源菌株可有效地从溶液中去除AFB1，这是最常见的黄曲霉毒素（El-Nezami等，1996，1998a）。El-Nezami等人 （1998b）评估了5种乳杆菌物质体外结合黄曲霉毒素的能力，发现益生菌菌株如鼠李糖乳杆菌GG和鼠李糖乳杆菌LC-705对于除去AFB1是非常有效的，其中在20μg mL-1溶液中超过80％的毒素被捕获。同时假设AFB2、AFG1和AFG2对这种结合过程不太敏感（El-Nezami等人2002b）。Peltonen等人 （2000）补充研究发现，益生菌从缓冲溶液中除去AFB1的范围为5.8-31.3％。 Peltonen等人 （2001）研究了12种乳杆菌和3种乳球菌菌株在PBS中对AFB1的结合能力。在他们的研究中，乳杆菌结合17.3-59.7％的AFB1，而乳球菌属菌株结合了5.6-41.1％的AFB1。 Khanafari等人 （2007）研究了植物乳杆菌（PTCC 1058）结合AFB1的功效，吸附1小时后从溶液中除去了45％的AFB1，高压灭菌的细菌去除AFB1的能力为1小时内约31％。 作者补充说，三次洗涤后，益生菌保留了92％的AFB1。 AFB1通过LAB的体外结合为快速（不超过1分钟）和可逆过程（Bueno等，2006），其为菌种和剂量依赖性（Kankaanpää等，2000）。
Hernandez-Mendoza等 （2009）根据结合AFB1的能力，筛选出8株干酪乳杆菌，其吸附率介于14〜49％。 以前的关于干酪乳杆菌对AFB1结合水平的研究发现其结合率介于0.6至46％之间（Bolognani等，1997; El-Nezami等，1998a; Peltonen等，2000,2001; Haskard等，2001; Lahtinen等 2004; Hwang et al.2005; Zinedine et al.2005）。 Hernandez-Mendoza等 （2010）提出，即使在长时间的毒素暴露后，干酪乳杆菌Shirota的存在也可以降低肠道水平的黄曲霉毒素吸收，从而降低其毒性作用。 他们补充说，干酪乳杆菌Shirota具有将AFB1结合到细菌细胞外套膜中的能力，并且图像还显示，黄曲霉毒素结合导致细菌细胞表面结构变化，从而改变了细菌细胞表面。
Halttunen等人 （2008）研究了LAB组合菌株去除霉菌毒素的能力，并揭示了LAB组合菌株的毒素去除能力不是其个体能力的总和。 因此，当目标是去除单一毒素时应使用纯的单一菌株，当要一起去除多种毒素时，使用组合菌株可能更有效。
Lankaputhra和Shah（1998）研究了6株嗜酸乳杆菌的活细胞和灭活细胞对8种化学诱变剂和前诱变剂（promutagens）（N-甲基，N'-硝基，N-亚硝基胍; 2-硝基呋喃; 4-硝基-O苯二胺; 4-硝基喹啉-N-氧化物; AFB1; 2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并喹啉; 2-氨基-1-甲基-6-苯基 - 咪唑并[4,5-b]吡啶和2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[3,3-6]吲哚）的抗诱变活性，包括AFB1。作者报道，除嗜酸乳杆菌2415株外，所有嗜酸乳杆菌菌株均在高浓度时抑制AFB1的基因毒性（> 50％）。发酵乳制品或益生菌的抗诱变活性的机理尚未明确（Nadathur等，1994）。诱变剂与微生物细胞的结合可能成为抗诱变性的作用机制（Orrhage等，1994）。Cenci等（2008）研究了鼠李糖乳杆菌GG对抗基因毒素的效果，包括AFB1（4-硝基喹啉-1-氧化物，N-甲基-N-硝基 - 亚硝基胍，2-氨基-3,4-二甲基咪唑并[4,5-f]喹啉和AFB1 ），结果显示其具有很高的抗AFB1基因毒性的能力（80.8％）。
根据污染水平和孵化期的不同，活的乳杆菌细胞浓度为108 CFU mL-1在PBS中的对AFM1结合率为10.22%〜26.55％（Kabak和Var 2008）。 他们补充道，热灭活细菌在PBS中去除AFM1的百分比为14.04%至28.97％。似乎灭活细胞的吸附能力更强。类似地，Kabak和Var（2004）发现，乳杆菌在PBS和复原乳中的AFM1的结合能力为25.7％至30.5％之间。 这些结果低于Pierides等报道的结果（2000），他发现，培养15~16h，活乳酸杆菌菌株结合AFM1能力为18.1%〜50.7％。
Ocharatoxin A 赭曲霉毒素A（OTA）
由于乳杆菌和链球菌的作用，在牛奶中观察到OTA的降解（Skrinjar等，1996）。 Turbic等 （2002）的研究结果显示，OTA（36-76％）被高浓度和适量浓度的鼠李糖乳杆菌菌株去除。同时，Heidler和Schatzmayr（2003）清楚地表明，从瘤胃液中分离的牛犊乳杆菌（Lactobacillus vitulinus）能够将OTA分解成无毒代谢物赭曲霉毒素α（OTα）和氨基苯丙氨酸。类似的研究表明，乳杆菌能够消除添加到培养基中的0.05 mg L−1 OTA，特别是保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌，分别消除了94％, 72％和46％的OTA（Böhm et al。2000）。
Del Prete et al.（2007）研究了OTA与葡萄酒LAB（乳杆菌属、片球菌属和欧洲绿球菌）的体外相互作用。 结果显示，在液体合成培养基中生长的几种葡萄酒LAB菌株引起的OTA浓度降低。 OTA浓度的降低范围为8.23％〜28.09％。 还有人注意到，商业亚麻型菌株比其他分析的葡萄酒LAB更有效，OTA降低范围为17.35至28.09％。
在肠道和植物来源的LAB菌株消除OTA的研究中，Piotrowska和Zakowska（2005）根据对OTA的敏感度及其从液体培养基中去除这种毒素的能力筛选出乳杆菌属和乳球菌属的29株LAB。 他们补充道，使用嗜酸乳杆菌CH-5、鼠李糖乳杆菌GG、植物乳杆菌BS、短乳杆菌和乳酸乳杆菌获得最大吸附量，除去超过50％的初始浓度的OTA。Piotrowska和Zakowska（2000）得出结论，通过与细菌生物量的结合发生毒素的消除。
Fuchs等人 （2008）研究了LAB对OTA的脱毒作用。他们发现，嗜酸乳杆菌对OTA含量的降低作用最强（97％）。因而值得注意的是，瘤胃代表微生物群落是通过裂解OTA肽键而解毒，从而有苯丙氨酸释放出来（Hult等，1976;Özpinar等，1999）。
Patulin展青霉毒素（棒曲霉毒素，PAT）
Fuchs等人 （2008）研究了LAB对展青霉毒素（PAT）的影响，并注意到植物乳杆菌降低PAT含量的作用最强（39％）。 Hateb等人 （2012a）报道，水溶液中PAT最大吸附量为培养24小时后的乳酸杆菌6149菌株，其活细胞达到51.1％，灭活细胞达到52.0％。 PAT的最高去除率条件为pH4.0和37℃，并且随着毒素浓度的降低而升高。有人使用10种不同的灭活LAB从苹果汁中去除PAT污染，结果表明,鼠李糖乳杆菌灭活细胞可降低PAT达80.4％（Hateb等，2012b）。
Fusarium toxins镰刀菌毒素
已知某些LAB菌株能够解毒镰刀菌毒素（DON、NIV、T-2毒素、HT-2毒素）（El-Nezami等，2002a; Niderkorn等，2006）和玉米赤霉烯酮（ZEN） （El-Nezami等，2002c，2004）。 Niderkorn等人（2006）发现，尽管伏马菌素FB1和FB2的化学结构相似，但FB2比FB1的去除率更高。 他们认为，是通过细菌细胞结合镰刀菌霉菌毒素而不是生物降解的方式去除毒素。因此，吸附脱毒不存在关于毒素的酶解产物的毒性问题。霉菌毒素-LAB相互作用的强度受细胞壁中肽聚糖结构的影响，更准确地说是受其氨基酸组成的影响（Niderkorn等人，2009）。
El-Nezami等人研究了鼠李糖乳杆菌GG和鼠李糖乳酸杆菌LC-705从液体培养基中去除ZEN及其衍生物α-玉米赤霉烯醇的能力（2002c）。他们注意到，这些毒素（38％和46％）中有相当一部分被细菌颗粒捕获，并且在培养3天后没有观察到ZEN或α-玉米赤霉烯醇的降解产物。 作者补充道，经过热处理和酸处理的细菌都能够去除ZEN和α-玉米赤霉烯醇，表明吸附作用才是从培养基中去除两种毒素的机制，而非代谢作用。该过程是快速的并且取决于细菌细胞及毒素的浓度。
Niderkorn等人 （2007）报道，8株乳杆菌和3种明串珠菌属将ZEN转化成α-玉米赤霉烯醇，但DON和伏马毒素不能被生物转化。 他们补充道，这不能被认为是解毒，因为α-玉米赤霉烯醇具有比ZEN高3到4倍的雌激素活性（Mirocha等，1979）。 从ZEN到α-玉米赤霉烯醇的生物转化可能解释了Mokoena等人的研究结果（2005），他们观察到LAB在玉米粉发酵过程中ZEN的浓度显着降低，但其毒性并没有降低。 意味着ZEN通过疏水相互作用主要结合LAB细胞壁的碳水化合物部分（El-Nezami等人，2004）。 由于疏水相互作用相对较弱，这种细菌-霉菌毒素复合物可能不稳定。 Niderkorn等人（2007）也提出，细菌吸附ZEN不限于疏水性连接，其他类型的相互作用可能也是重要的。
霉菌毒素的体外去除机制
为了研究LAB去除霉菌毒素的机制，有许多研究比较了活菌和热灭活菌的作用（Haskard et al.2001; El-Nezami et al。1998b，2002a）。或者，将细菌细胞用酶（如链霉蛋白酶E和脂肪酶）或高碘酸盐处理，以改变细胞壁结构（Haskard等人2000; El-Nezami等人2004; Lahtinen等人2004）。 然而，由于LAB的细胞溶质制剂也有降低毒性的作用，所以假定其他机制（例如与短链脂肪酸的相互作用）也可能发挥作用（Knasmuller et al.2001; Stidl et al 2007; Stidl等人2008）。
在LAB中，细胞壁组成包括（1）肽聚糖层，其形成容纳其它组分如磷壁酸和脂磷壁酸的细胞壁的主要结构；（2）蛋白质S层，以及（3）中性多糖（Delcour等人1999）。这些组分具有各种功能，包括粘附以及与大分子结合。各种实验的结果表明，肽聚糖和多糖参与毒素吸附（Zhang和Ohta， 1991; Peltonen等，2001; Haskard等，2001; Lahtinen等，2004）。 Haskard等人（2000）研究了AFs和鼠李糖乳杆菌之间结合的机制，发现结合主要发生在碳水化合物上，并且一些扩展了细胞壁中的蛋白质组分。这些结果是基于高碘酸酯和链霉蛋白酶E对鼠李糖乳杆菌AFB1结合的抑制作用。高碘酸酯和链霉蛋白酶E可分别用于相对非特异性降解碳水化合物和蛋白质。他们还描述了疏水相互作用在结合中的主要作用，静电相互作用次之。
另外，已经表明AFB1通过弱的非共价相互作用结合细菌，例如与细菌表面上的疏水基团相关联（Peltonen等，2001）。 然而，AFB1结合可能涉及多个成分（Turbic等人，2002），并且这种相互作用可能受环境条件的影响。
霉菌毒素的体内去除机制
已经显示几种益生菌在体外能有效地结合AFB1（Lee等人2003; Shahin 2007），但离体结果有争议（El-Nezami等人2000）。因为在动物肠道环境条件下其结果可能完全不同，例如pH（Haskard et al.2000,2001）和肠粘液。Gratz等人 （2004）报道，将两种益生菌制剂（鼠李糖乳杆菌GG和鼠李糖乳杆菌LC-705加弗拉登克氏原乳杆菌shermanii JS（LC-705 + JS）与AFB1或粘液的预培养分别减少了随后的粘液和AFB1的表面结合 ，表明复合的益生菌制剂在粘液存在下对AFB1的吸附减少，并且更易受肠道中干扰因子的影响，这可能解释动物体内AFB1结合较差的原因（Gratz等人，2004）。
2005年，Gratz等研究了益生菌混合物（鼠李糖乳杆菌LC-705加弗氏弗氏厌心菌亚种shermanii JS）离体结合AFB1的能力。结果显示，益生菌混合物使十二指肠中AFB1的水平降低了25％。 此外，Tuomola等人 （2000）的研究显示，热处理可以干扰鼠李糖乳杆菌GG和LC-705的粘液粘附力，并得出结论：蛋白质必须参与粘液的结合，而碳水化合物可与AFB1结合（Haskard等，2000）。
还有证据表明，具有最有效的AFB1去除能力的LAB可以减少AFB1在鸡的胃肠道中被鸡吸收（El-Nezami等人，2000）。 根据El-Nezami等人 （2006）的发现，使用两种益生菌菌株减少了年轻中国男性对AFB1的吸收。
Hernandez-Mendoza等（2011）评估了罗伊氏乳杆菌在肠道中结合AFB1的能力，并确定该菌株能够在肠道中结合AFB1，主要在十二指肠中，并且在接受AFB1加细菌的动物中AFB1-赖氨酸加合物的含量明显低于仅接受AFB1的AFB1-赖氨酸加合物，因此证明细菌在正常肠道条件下作为生物屏障的能力，从而降低口服摄入的AFB1的生物利用度。 Hathout等人 （2011）评估了干酪乳杆菌和罗伊氏乳杆菌对大鼠AF-诱导的氧化应激的保护作用，并报道了用细菌处理能够显着改善肝脏的所有生物化学参数和组织学图像。
结论
活的或灭活的乳酸菌可以通过将毒素结合到其细胞壁组分，或通过将毒素降解为毒性较低或无毒的化合物，从而实现去除食物或饲料中的霉菌毒素。鼠李糖乳杆菌GG、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等可利用其细胞壁中的肽聚糖有效地结合霉菌毒素。乳杆菌和双歧杆菌对霉菌毒素的结合能力，可应用为食品与饲料中的霉菌毒素脱毒剂。